Lorsque saint Paul entreprit son dernier voyage vers Jérusalem, afin d'y porter les fruits de la collecte recueillie dans toutes les Eglises pour venir en aide aux chrétiens de la ville sainte (Actes 20), Timothée se trouvait encore parmi ses compagnons de voyage. Il assista à son arrestation (Actes 22 et sv), le suivit à Césarée et à Rome pendant sa première captivité; mais de là Paul l'envoya en mission auprès de l'Eglise de Philippes (Phil. 2:19-24). Il vint le rejoindre en Orient, une fois délivré, et le plaça finalement à la tête de l'Eglise d'Ephèse, en lui recommandant d'organiser le culte et la vie chrétienne, de combattre les faux docteurs, de choisir avec discernement les membres de la hiérarchie ecclésiastique et de mener en tout temps le troupeau du Christ dans la paix, la concorde et la vérité (I Tim.). Dans une seconde lettre, envoyée par l'apôtre prisonnier à Rome et attendant la mort, il invite son fidèle disciple à venir le rejoindre pour l'assister dans ses derniers moments (II Tim. 4:8). Timothée fut alors arrêté, mais bientôt remis en liberté (Heb. 13:23). Il retourna dans son diocèse après la mort de l'apôtre.
On rapporte qu'il rencontra à Ephèse saint Jean le Théologien, qu'il reçut de lui un surcroît de grâce et d'illumination spirituelle et qu'une fois l'apôtre exilé à Patmos, il gouverna l'Eglise en rassemblant en lui-même l'esprit de saint Jean et celui de saint Paul. Un jour, comme les païens de la cité se préparaient à célébrer une de ces fêtes qui se terminaient toujours par des orgies et des meurtres, saint Timothée tenta de s'interposer et de les faire revenir à la raison. Mais ces gens, devenus semblables à des bêtes furieuses, se jetèrent alors sur lui et le rouèrent de coups. Ses disciples parvinrent de justesse à le tirer de la mêlée et le transportèrent à demi-mort sur une hauteur voisine, où il remit bientôt son âme à Dieu.
Le corps de saint Timothée fut enseveli non loin du tombeau de saint Jean et, bien longtemps après, en 356, ses précieux restes furent transférés solennellement à Constantinople par saint Artémios (voir au 20 oct.), avec ceux de saint André et de saint Luc, pour être déposés dans l'église des Saints-Apôtres. Ils accomplirent là de nombreux miracles, jusqu'à ce que les Croisés latins les dérobent, lors du pillage de la ville en 1204
